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成功案例

PCR引物多半是不适用的

来源:未知日期:2019-02-09 16:34 浏览:

  自PCR技术诞生以来已经有三十年了。从经典PCR、实时定量PCR再到现在的数字PCR,这一技术在不断蜕变却从未淡出我们的视野。

  重组酶聚合酶扩增RPA(Recombinase Polymerase Amplification),被称为是可以替代PCR的核酸检测技术。英国公司TwistDx Inc以此为基础开发的TwistAmp 核酸扩增产品,能够在15分钟内进行常温下的单分子核酸检测。该技术对硬件设备的要求很低,特别适合用于体外诊断、兽医、食品安全、生物安全、农业等领域。

  常规PCR必须经过变性、退火、延伸三个步骤,而PCR仪本质上就是一个控制温度升降的设备。RPA反应的最适温度在37C-42C之间,无需变性,在常温下即可进行。这无疑能大大加快PCR的速度。此外,由于不需要温控设备,RPA可以真正实现便携式的快速核酸检测。

  据介绍,RPA检测的灵敏度很高,能够将痕量的核酸(尤其是DNA)模板扩增到可以检出的水平,从单个模板分子得到大约1012扩增产物。而且RPA还用不着复杂的样品处理,适用于无法提取核酸的实地检测。

  RPA既可以扩增DNA也可以扩增RNA,还省去了额外的cDNA合成步骤。你不仅可以对扩增产物进行终点检测,还可以对扩增过程进行实时监控,甚至可以通过试纸条(侧流层析试纸条LFD)读取结果。

  目前,TwistAmp试剂盒的扩增子长度在500bp以内。不过,经过特别优化的RPA扩增,也可以生成更长的扩增产物,或者减慢扩增速度(便于定量),甚至在更低的温度下进行反应。(详见TwistDx Inc公司官网:

  RPA技术主要依赖于三种酶:能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也有活性,最佳反应温度在37C左右。

  重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物,能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列,就会发生链交换反应形成并启动DNA合成,对模板上的目标区域进行指数式扩增。被替换的DNA链与SSB结合,防止进一步替换。在这个体系中,由两个相对的引物起始一个合成事件。整个过程进行得非常快,一般可在十分钟之内获得可检出水平的扩增产物。

  RPA扩增的基础体系(TwistAmp Basic)含有DNA扩增所需的所有试剂,我们只要准备好引物和模板就行。扩增结果可以通过凝胶电泳进行终点检测,产物纯化后可用于下游研究。

  在这个基础体系中添入不同的酶和探针,就可以实现多样化的RPA应用。举例来说,在基础体系里添加逆转录酶(TwistAmp Basic RT),可以对RNA模板进行一步法扩增。

  将RPA基础体系、专利的exo探针技术和核酸外切酶III结合起来(TwistAmp exo),能实现数据的实时读取,就像荧光定量PCR一样。不过反应终点的扩增子总量有所减少,适合获得强荧光信号进行动力学分析,不适合终点检测(比如跑胶)。在TwistAmp exo的基础上加入逆转录酶(TwistAmp exo RT),就可以一步实现RNA模板的实时扩增。

  RPA基础体系、fpg探针技术和核酶fpg相结合,形成了一个实时报告体系(TwistAmp fpg)。这个体系的荧光累积比较慢,但终点的扩增子产量不会减少,因此也能支持终点分析。

  RPA基础体系与核酶nfo的结合(TwistAmp nfo),能支持“三明治法”的终点检测,比如测流层析试纸条LFD。

  除此之外,RPA扩增还可以很简单的实现多重化。只需要增加引物/探针就可以一次性检测多个扩增产物。

  RPA分析的关键在于扩增引物和探针的设计。PCR引物多半是不适用的,因为RPA引物比一般PCR引物长,通常需要达到30-38个碱基。引物过短会降低重组率,影响扩增速度和检测灵敏度。

  在设计RPA引物时,变性温度不再是影响扩增引物的关键因素。RPA的引物和探针设计不像传统PCR那样成熟,用户需要自己摸条件进行优化。虽然还没有设计软件可以使用,不过TwistDx Inc公司在自己的网站上提供了相应的筛选指南。

  需要注意的是,目前的TwistAmp扩增试剂盒都没提供RNase抑制剂。另外,受目前的生产方法所限,RPA反应不适合用于i标准实验室菌株的扩增。

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